Elispot（酶联免疫斑点分析）是一种用于检测和计数分泌特定蛋白质（如细胞因子、抗体或颗粒酶）的单个细胞的免疫学检测方法。该技术结合了细胞培养和酶联免疫吸附测定的原理，能够在单细胞水平上评估免疫细胞的分泌功能，广泛应用于疫苗免疫效果评价、细胞免疫监测、肿瘤免疫研究及细胞治疗产品的功能检测。与ELISA测定总体分泌量不同，Elispot能够显示有多少个细胞在分泌目标分子，提供了细胞频率和功能强度的信息。
该技术的核心原理是将特异性抗体预先包被在微孔板的膜表面。将待测细胞加入孔中并在适宜条件下培养一段时间，细胞分泌的目标分子（如IFN-γ、IL-2、TNF-α或抗体）被膜上的抗体捕获，在细胞周围形成局部富集。培养结束后洗去细胞，加入酶标记的检测抗体，再与底物反应。底物在酶催化下形成不溶性有色沉淀，在膜上留下一个斑点。每个斑点代表一个曾经分泌目标分子的细胞。通过计数斑点数量并结合加入的细胞总数，可计算出分泌该分子的细胞频率。以下从主要类型、操作流程和注意事项三个方面展开介绍。
一、主要类型与应用
1.酶联免疫斑点分析：以酶促显色反应为基础，使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记检测抗体，底物在酶催化下形成不溶性有色沉淀。该方法使用普通的体视显微镜或自动读板仪即可计数，成本相对较低。
2.荧光免疫斑点分析：使用荧光标记的检测抗体，通过荧光读板仪进行检测。可同时检测两种或多种分析物，适用于多色分析。
3.主要应用领域：
-疫苗评价：用于检测疫苗接种后特异性T细胞分泌IFN-γ或IL-2的频率，评估细胞免疫应答强度。
-感染与免疫监测：用于结核病、HIV、巨细胞病毒等感染中特异性T细胞反应的检测。
-肿瘤免疫研究：用于评估肿瘤浸润淋巴细胞或外周血中肿瘤特异性T细胞的功能。
-细胞治疗产品质控：用于检测CAR-T细胞或TCR-T细胞对靶细胞的反应性。
-自身免疫与移植研究：用于监测免疫耐受或排斥反应相关的细胞因子分泌谱。
二、操作流程与要点
1.板准备：使用无菌操作将捕获抗体加入Elispot板孔中，4℃包被过夜。次日弃去包被液，用无菌PBS洗涤，加入封闭液在室温下封闭1-2小时，防止非特异性结合。
2.细胞准备：将待测细胞（如外周血单个核细胞）按适当密度加入孔中，同时设置阴性对照（仅培养基）、阳性对照（如植物血凝素或抗CD3/CD28抗体刺激）和空白孔。
3.刺激培养：加入特异性抗原或刺激物后，在37℃、5%CO₂培养箱中培养12-48小时。培养时间取决于目标分子和刺激类型。
4.检测与显色：弃去细胞悬液，用含吐温的PBS洗涤，加入生物素化检测抗体孵育，再依次加入酶结合物和底物。显色达到适当强度后用去离子水冲洗终止反应。
5.斑点计数与结果分析：将板晾干，使用自动读板仪或体视显微镜计数斑点。结果通常以斑点形成细胞数/10⁶细胞表示，需扣除阴性对照的背景斑点。
三、使用注意事项
1.无菌操作：细胞培养阶段应严格遵守无菌操作，避免污染导致实验失败。
2.细胞活力与数量：加入的细胞应具有较高活力，数量需根据预期分泌频率调整。细胞过多会导致斑点融合难以计数，过少则可能检测不到。
3.刺激条件优化：抗原浓度、刺激时间和培养条件需根据实验目的进行预实验优化。阳性对照应能产生稳定的应答。
4.洗涤操作：洗涤不充分会导致背景偏高；洗涤过于剧烈可能导致斑点脱落或膜损坏。
5.读板一致性：使用自动读板仪时需设定统一的计数参数，人工计数应保持一致的判读标准。
Elispot分析通过在单细胞水平上检测分泌功能，为免疫学研究和疫苗评价提供了一种有价值的检测手段。其操作流程包括板包被、细胞培养、检测显色和斑点计数等步骤，各环节需注意无菌操作、细胞活力和洗涤条件。结果解读时应结合阴性对照和阳性对照进行判断。通过规范操作和条件优化，Elispot分析可在细胞免疫监测和功能评价中提供可靠的数据支持。
更新时间：2026-10-12
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