在免疫学、疫苗研发、肿瘤免疫治疗和传染病研究领域，精准评估T细胞或B细胞的功能性免疫应答至关重要。ELISPOT（酶联免疫斑点试验，Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay）作为一种高灵敏度、单细胞水平的细胞因子或抗体分泌检测技术，被誉为“免疫反应的显微镜”，能够直观、定量地揭示特定抗原刺激下免疫细胞的活化状态，已成为现代免疫监测的核心工具之一。
一、工作原理
ELISPOT的基本原理类似于Western Blot与细胞培养的结合，其核心在于捕获并可视化单个活化免疫细胞分泌的目标分子（如IFN-γ、IL-2、IL-4、Granzyme B或IgG）。具体步骤如下：
1.包被：将特异性捕获抗体（如抗IFN-γ抗体）固定在PVDF膜底的96孔板上；
2.细胞孵育：加入外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的T/B细胞，并加入抗原、肽段或多克隆刺激物；
3.分泌与捕获：活化的细胞在数小时至数十小时内分泌细胞因子，随即被周围包被抗体原位捕获；
4.检测：移除细胞后，加入生物素标记的检测抗体，再通过酶标亲和素（如HRP-Streptavidin）催化底物（如BCIP/NBT）显色；
5.结果读取：每个分泌细胞在膜上形成一个清晰的紫色或蓝色斑点（“spot”），斑点数量即代表抗原特异性效应细胞的频率。
整个过程在单细胞分辨率下完成，灵敏度可达每10万~100万个细胞中检测到1个阳性细胞，远高于流式细胞术或ELISA。
二、性能特点
1.超高灵敏度
能检测极低频率的抗原特异性T细胞（0.01%~0.001%），特别适用于弱免疫应答或稀有细胞群研究。
2.功能导向，反映细胞活性
不仅识别细胞表型，更直接反映其功能性分泌能力，是评估免疫应答“质”与“量”的金标准之一。
3.单细胞分辨率
每个斑点对应一个活化细胞，可进行频率统计与比较，数据直观、可重复性强。
4.多因子检测能力
通过荧光标记（FluoroSpot）技术，可在同一孔中同时检测两种或多种细胞因子（如IFN-γ/IL-2双色），分析细胞多功能性（polyfunctionality）。
5.样本需求量少
通常仅需10⁵~10⁶个PBMCs，适合临床有限样本（如儿童、肿瘤患者）的研究。
三、主要应用领域
1.疫苗研发与评价
在新冠、HIV、结核、疟疾等疫苗临床前及临床试验中，ELISPOT用于评估候选疫苗诱导的T细胞免疫应答强度与广度，是FDA和EMA推荐的关键免疫原性指标。
2.肿瘤免疫治疗监测
在CAR-T、TCR-T、PD-1/PD-L1抑制剂等疗法中，通过检测肿瘤抗原特异性T细胞的斑点形成情况，动态评估治疗效果与免疫重建状态。
3.自身免疫与过敏研究
分析Th1/Th2/Th17等亚群分泌谱，揭示疾病机制；例如，在1型糖尿病中检测胰岛抗原反应性T细胞。
4.传染病免疫学
用于结核潜伏感染诊断（如T-SPOT.TB检测）、EBV、CMV、HPV等病毒特异性T细胞应答评估。
5.移植免疫监控
监测受者对供体抗原的免疫反应，预测排斥风险或耐受状态。
ELISPOT分析以其独特的单细胞功能检测能力，在精准免疫学研究中占据不可替代的地位。随着自动化斑点计数仪、标准化试剂盒和多色FluoroSpot平台的普及，其操作便捷性和数据可比性不断提升。未来，在个体化医疗、伴随诊断和免疫疗效预测等领域，ELISPOT将继续作为连接基础免疫机制与临床转化应用的重要桥梁，为人类健康提供强有力的科学支撑。
更新时间：2026-02-10
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