细胞凋亡是细胞程序化的死亡过程，精准检测凋亡水平是细胞生物学、药理学等领域的核心实验手段。目前细胞凋亡实验的常用方法主要围绕凋亡不同阶段的特征(细胞膜外翻、DNA 断裂、Caspase 活化等)设计，以下是各类方法的原理、操作要点及注意事项。
一、 Annexin V-FITC/PI 双染法(检测早期凋亡)
1. 实验原理
凋亡早期细胞的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜内侧外翻至外侧，Annexin V 可与 PS 特异性结合；碘化丙啶(PI)无法穿透活细胞完整的细胞膜，仅能对凋亡晚期或坏死细胞的细胞核染色。通过双染可区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡 / 坏死细胞。
2. 核心操作要点
样本制备
贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化，避免 EDTA 破坏细胞膜；离心收集细胞，用预冷的 PBS 洗涤 2 次，调整细胞浓度至 1×10⁵~1×10⁶ 个 /mL。
悬浮细胞：直接离心收集，洗涤后调整浓度，避免细胞聚集。
染色步骤
加入 500 μL 配套的结合缓冲液重悬细胞，不可用 PBS 替代，防止渗透压失衡影响 Annexin V 结合。
依次加入 Annexin V-FITC 和 PI 染液，轻轻混匀，室温避光孵育 10~15 min。
孵育完成后 1 h 内上机检测，避免 PI 渗透进正常细胞导致结果偏差。
结果判定
流式细胞仪检测：Annexin V⁻/PI⁻ 为活细胞；Annexin V⁺/PI⁻ 为早期凋亡细胞；Annexin V⁺/PI⁺ 为晚期凋亡 / 坏死细胞。
3. 注意事项
全程避光操作，防止荧光淬灭；
胰酶消化时间不宜过长，避免细胞损伤引发假阳性。
二、 TUNEL 法(检测晚期凋亡，DNA 断裂)
1. 实验原理
凋亡晚期细胞的染色体 DNA 会发生断裂，产生大量 3'-OH 末端。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可将荧光素或生物素标记的 dUTP 连接到 DNA 末端，通过荧光显微镜或流式细胞仪检测标记信号，判断凋亡水平。
2. 核心操作要点
样本预处理
细胞爬片：用 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% Triton X-100 通透处理 2~5 min，过度通透会破坏细胞结构，不足则试剂无法进入细胞核。
组织切片：需进行脱蜡、水化处理，确保试剂穿透组织。
孵育与显色
滴加 TUNEL 反应液(含 TdT 酶和标记 dUTP)，37℃ 避光孵育 60 min，孵育温度过高会导致酶失活。
用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，洗去未结合的标记物。
荧光法直接在荧光显微镜下观察；显色法需加入 DAB 底物液，室温显色 5~10 min 后镜检。
对照设置
阳性对照：用 DNase I 处理样本，诱导 DNA 断裂；
阴性对照：用 PBS 替代 TdT 酶，排除非特异性结合。
3. 注意事项
反应液需现配现用，避免 TdT 酶活性下降；
组织切片的通透程度需根据组织类型调整，致密组织可适当延长通透时间。
三、 Caspase 活性检测法(检测凋亡核心通路)
1. 实验原理
Caspase 家族是凋亡执行的关键蛋白酶，其中 Caspase-3 是核心执行者。该方法利用 Caspase 特异性底物(如 DEVD-AMC)，底物被活化的 Caspase 切割后会释放荧光基团，通过检测荧光强度反映 Caspase 活性，间接表征凋亡水平。
2. 核心操作要点
细胞裂解
收集细胞，加入预冷的裂解液，冰上裂解 15~30 min，期间反复吹打使细胞充分裂解。
4℃ 下 12000 rpm 离心 10 min，取上清液，避免细胞碎片干扰检测。
酶促反应与检测
按比例混合上清液、底物溶液和反应缓冲液，37℃ 孵育 1~2 h。
用荧光酶标仪检测荧光强度(激发波长 380 nm，发射波长 460 nm)，荧光强度越高，代表 Caspase 活性越强，凋亡水平越高。
特异性验证
加入 Caspase 特异性抑制剂，若荧光强度显著下降，说明检测信号来自目标 Caspase 的活化。
3. 注意事项
裂解液需新鲜配制，避免蛋白酶抑制剂失效；
孵育时间需严格控制，防止底物耗尽导致信号饱和。
四、 实验方法选择原则
检测早期凋亡优先选 Annexin V-FITC/PI 双染法；
研究凋亡晚期的 DNA 损伤或组织样本的凋亡定位，选 TUNEL 法；
探究凋亡通路的分子机制，需结合 Caspase 活性检测法；
为提高实验可信度，可采用两种及以上方法联合检测。
更新时间：2026-01-23
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